В раннем возрасте поступил в ученики к фламандскому живописцу Денису Калверту; перейдя затем в школу Лодовико Карраччи, из неё перешёл с целью усвоить себе технику фресковой живописи к Феррантини. В период становления Рени расписал фасад палаццо Цани в Болонье и исполнил для тамошней церкви Сан-Микеле-ин-боско образ «Св. Бенедикт в пустыне».
В 1596 г. Рени уезжает в Рим, где занялся основательным изучением произведений Рафаэля. Одним из первых произведений, написанных в Риме, была картина «Мучения апостола Петра». Работая в Риме художник быстро добился признания. Среди его высокопоставленных заказчиков были кардинал Пьетро Альдобрандини (1571-1621), близкий родственник папы Климента VIII для которого в 1605 году Рени написал алтарный образ "Распятие св. Петра" . В этой работе особенно сильно ощущается влияние манеры Караваджо , живописные эксперименты которого взбудоражили тогдашний художественный мир.
Многочисленные картины и монументальные росписи исполнялись Рени с восхищавшей современников легкостью и артистизмом. Он изображал в них традиционный для раннего барокко круг эпизодов и персонажей из священной истории, мифологии и житий святых с преимущественным интересом к эффектным и ярко зрелищным мотивам, в частности, к сценам апофеозов и мученичеств.В 1619 года, после смерти Лодовико Карраччи, Гвидо Рени становится главой Болонской Академии. А в 1629 избирается руководителем Академии св. Луки. После 1622 года он живет и работает преимущественно в Болонье.
Guido Reni умер 18 августа 1642 года в возрасте 66 лет.Местом его упокоения стала одна из главных церквей Болоньи - базилика Сан-Доменико.